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Projektübersicht

• Funktionelle Splicingregulation von va riablen Exonen onkologisch bedeutsamer Gene
• Pathologisches alternatives Splicing in Ovarialkarzinomen
• Expression profiles of splicing factors in matched pairs of breast cancer and corresponding normal breast tissue (SR proteins and Tra2 beta)
• Expressionsanalyse von FOX Isoformen in matched pairs Mammakarzinomen und korrespondierendem Normalgewebe sowie Analyse in Tissue Arrays von Mammakarzinomen
• Expressionsanalyse von Tra2 beta1, hnRNP, PP1 in matched pairs Mammakarzinomen und korrespondierendem Normalgewebe sowie Analysen in Tissue Arrays von Mammakarzinomen
• Genexpressionsanalyse in primären Mammakarzinomen zur Prädiktion des Ansprechens auf eine primär systemische Chemotherapie

Funktionelle Splicingregulation von variablen Exonen onkologisch bedeutsamer Gene

Nachweis von spezifischen Regulation des alternativen Splicings von onkologisch für die Metastasierung und Angiogenese bedeutsamen Genen: Adhäsionsmoleküle: CD44v4 und v5, Angiopoetin, VEGF und MAC25.
Ko-Transfektionsexperimente in HeLa Zellkuturen mit Minigenen, die die variablen Exons ihrer natürlichen genomischen Umgebungs-sequenz enthalten. Titrationsexperimente mit steigenden Konzentrationen von Expressionsplasmiden für Splicingfaktoren und anderen SR Proteinen, um die Spezifität der Effekte nachweisen zu können. Nachweis der Splicingphenotypen durch RT-PCR Analysen (fluoreszenzmarkiert zur Quantifizierung).

Pathologisches alternatives Splicing in Ovarialkarzinomen

Hintergrund

Alternatives Splicing stellt einen wesentlichen Mechanismus zur Regulation der Genexpression dar. Ca. 50-60% aller humanen Gene werden durch diesen komplexen nukleären Prozeß reguliert, inklusive multipler tumorbiologisch bedeutender, wie z.B. solche der Signaltransduktion, Apoptoseregulation, Adhäsionsmoleküle, Steroidrezeptoren. Obwohl viele deskriptive Studien ein verändertes alternatives Splicing in vielen Tumoren nachweisen konnten, sind die molekularen Grundlagen bisher nur teilweise verstanden. In einem Mausmodell zur Brustkrebsentwicklung konnten wir in vivo Expressionveränderungen von nukleären Proteinen, die als sog. Splicingfaktoren alternatives Splicing regulieren, identifizieren. Hierzu gehörte neben Proteinen der argenin-serin-reichen SR-Proteine (SRp20, SC35, SRp40, SRp55, SRp75) auch das Tra2-beta Protein.

Parallel zu diesen Phänomenen veränderte sich auch das alternative Splicing des CD44 Gens, welches mit Tumorprogression und Metastasierung von Tumoren inklusive des Ovarialkarzinoms assoziiert wird. Für diese Tumorentität konnten wir bereits zuvor ein gestörtes alternatives Splicing nachweisen.
In weiteren funktionellen Experimenten konnten wir auch die ersten spezifischen Regulatoren des alternativen CD44 Splicings identifzieren. Sowohl der Transkriptionsfaktor YB-1 als auch das Tra2 Protein interagieren über sogenannte A/C-reiche Exon-Enhancer Elemente innerhalb der variablen Exons spezifisch mit dem CD44 Gen und kontrollieren so deren Expression.

Projekt-Ziele und Durchführung

In dem hier vorgestellten Projekt möchten wir anhand der TOC Tumordatenbank untersuchen, welche tumorbiologische Signifikanz veränderte Expressionsmuster von Splicingfaktoren in Ovarialkarzinomen haben. Zu diesem Zweck wird die Expression spezifischer nukleärer Proteine (SR Protein- Familie, YB-1 und Tra2), die als spezifische Regulatoren des alternativen Splicings bekannt sind, sowohl auf Protein- als auch auf RNA-Ebene, analysiert.
Ein weiterer Schwerpunkt unserer Arbeiten wird zudem auf funktionellen Analysen liegen, die den Einfluß der induzierten Aktivierung bzw. Inaktivierung verschiedener Splicingfaktoren auf das alternative Splicing untersuchen. Als Zielgene werden neben dem bereits erwähnten exzessiv gesplicten CD44 weitere, für das Ovarialkarzinom relevante, alternativ gesplicte Gene eingesetzt.

Expression profiles of splicing factors in matched pairs of breast cancer and corresponding normal breast tissue (SR proteins and Tra2 beta)

Detection of expression profiles of splicing factors in breast cancer and corresponding normal breast tissue, with a focus on SR proteins and Tra2 by RT-PCR and Western Blot analysis. Correlation to histopthological parameters like TNM status, ER/PR , Her2/neu expression, menopausal status, age, G- and L- status. Functional analysis of splicing regulation of specific splicing factors, esp. SR proteins and tra2 on alternatively spliced target genes by co- transfection experiments with reportergenes including the target sequences and expression plasmids for the specific splicing factors.

tra2ß RT-PCR

Expressionsanalyse von FOX Isoformen in matched pairs Mammakarzinomen und korrespondierendem Normalgewebe sowie Analyse in Tissue Arrays von Mammakarzinomen

Nachweis von Veränderungen der Expression der onkologisch bedeutsamen FOX in primären Mammakarzinomen durch RT-PCR und Western Blot. Korrelation mit T (hier Stratifizierung nach Multi-/ Unizentrizität), N, M, Grading, ER/PgR - , Her2 – Status, Menopausenstatus (bzw. Alter >50 LJ, <50 LJ), Lymphangiosis.
Zudem Analyse der FOX Expression an Tissue Arrays.

Expressionsanalyse von Tra2 beta1, hnRNP, PP1 in matched pairs Mammakarzinomen und korrespondierendem Normalgewebe sowie Analysen in Tissue Arrays von Mammakarzinomen

Nachweis von Veränderungen der Expression dieser funktionell im Prozess der alternativen Splicingregulation wichtigen Gengruppe in primären Mammakarzinomen durch RT-PCR und Western Blot. Korrelation mit klinisch pathologischen Parametern (hier Stratifizierung nach Multi-/ Unizentrizität), N, M, Grading, ER/PgR - , Her2 – Status, Menopausenstatus (bzw. Alter >50 LJ, <50 LJ), Lymphangiosis. Einsatz der Iommunhistochemie an Tissue Arrays.

Genexpressionsanalyse in primären Mammakarzinomen zur Prädiktion des Ansprechens auf eine primär systemische Chemotherapie

Studienziel

Entwicklung eines prädiktiven Tests für das Ansprechen auf eine primär systemische Chemotherapie mit Docetaxel, Epirubicin und Cyclophosphamid bei Patientinnen mit einem primären Mammakarzinom durch eine Genexpressionsanalyse auf RNA Ebene mit Hilfe von Micro-Array-Technologie.

Patientenkollektiv:

Patientinnen >18 Jahre mit einem histologisch gesicherten mono-zentrischen Mammakarzinom grösser 2,5 cm mit und ohne Lymphknotenmetastasen, die sich nach Ausschluss einer Fernmetastasierung, einer primär systemischen Chemotherapie nach dem NSABP-B27 Protokoll (4xEC (90/600 mg2), sequentiell gefolgt von 4xDocetaxel (100 mg/m2) q3w) unterziehen.