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Methoden

In der AG werden zur Wirkungsforschung zell- und molekularbiologische Methoden angewendet.

Kultivierung von primären HCC-Zellen und HCC-Zelllinien

Zur Analyse der Wachstumshemmung von Leberkarzinomzellen durch Naturstoffe werden von uns primäre HCC-Zellen aus Tumorgewebe isoliert und kultiviert. Als weitere Modellsysteme verwenden wir zusätzlich etablierte HCC-Zelllinien, die sich in ihrem Status an Tumorsuppressorgenen von einander unterscheiden. In den Abbildungen unten sind primäre HCC-Zellen (links), HepG2/wt p53 (mitte), Huh7/mut p53 (rechts) dargestellt.  

Nachweis der Proteinexpression zur Zell-Charakterisierung und Aufklärung von Signaltransduktionspfaden in Einzelzellen

Die Verifizierung und Charakterisierung der Zellisolate erfolgt u. a. mittels indirekter Immunfluoreszenz. Dabei werden spezielle Antikörper gegen Proteine, die selektiv in Hepatozyten exprimiert werden, verwendet. In der linken Abbildung ist eine FL-Färbung von Albumin mittels mAb (rot) und DAPI-Kerngegenfärbung (blau) in Huh-7-Zellen dargestellt. Rechts daneben erfolgte eine Erfassung von phospho-ATM (violett) in behandelten HCC-Zellen durch Immunfluoreszenzfärbung. Der Kern wurde hier ebenfalls mit DAPI angefärbt.

Untersuchung von Zellviabilität, Zellzyklusverteilung und Apoptose

Die Erfassung der Wachstumshemmung durch Naturstoffe erfolgt mit Hilfe von Methoden, die Zellzyklusverteilung, Zellviabilität sowie Apoptose untersuchen. Hierzu bedienen wir uns der Durchflusszytometrie (Bilder oben) sowie kolorimetrischen, fluoreszenzspektro-metrischen sowie luminometrischen Assays (Bild unten links). Im live cell imaging werden zeitkinetische, apoptotische Prozesse visuell erfasst und dargestellt (Bild unten rechts).

Analyse der Modifikation des Expressionslevels von HCC-Zellen durch Naturstoffe auf Gen- und Proteinebene

Um die Relevanz der Regulation von Tumorsuppressoren und Onkogenen bei der Wachstumshemmung durch Naturstoffe zu untersuchen, werden Genexpression, Proteinlevel und – im Falle der Telomerase – Enzymlevel analysiert. Dabei kommen verschiedene molekularbiologische Methoden zum Einsatz wie z.B. RT-PCR, Immunoblotting, Mutationsanalyse oder spezifischer, transienter mRNA knock down durch RNAi Technik.

Diplom-/Master-/Bachelorarbeiten mit externen Kooperationspartnern:

Hochmotivierte Studierende, die Interesse haben eine Diplom-/Master-/Bachelorarbeit in unserer AG durchzuführen, sind herzlich eingeladen, sich unter der e-mail-Adresse Angelika.Reichinger@uniklinik-freiburg.de zu melden.

…laufende Arbeiten:

• Wirkung von Isothiocyanaten auf die nicht-alkoholische Fettleber und nicht alkoholische Steatohepatitis im metabolischen Syndrom in einem Hepatozytenmodell (in vitro)
  Bearbeiterin: Franziska Schmid
  Externer Betreuer: Prof. Dr. F. Bigge (FH Furtwangen, Fakultät Maschinenbau und Verfahrenstechnik)

…abgeschlossene Arbeiten:

• Immunmodulatorische Wirkungen von Isothiocyanaten (2011)
  Bearbeiterin: Jana Schell
  Externer Betreuer: Prof. Dr. G. Neuhaus (Universität Freiburg, Fakultät für Biologie)
  
• Untersuchung der Relevanz der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in der Isothiocyanat-vermittelten Wachstumsinhibition von Leberkrebszellen (2010)
  Bearbeiter: Valentin Holzwart
  Externe Betreuerin: Prof. Dr. Ch. Zell (FH Offenburg, Fachbereich Maschinenbau und Verfahrenstechnik)
  
• Nachweis eines chemopräventiven Potentials von Senf (Sinapis alba) in einer kontrollierten humanen Interventionsstudie unter Verwendung zytogenetischer und molekularbiologischer Analysen (2010)
  Bearbeiter: Manuel Garcia-Käufer
  Externer Betreuer: Prof. Dr. P. Beyer (Universität Freiburg, Fakultät für Biologie)
• Die Rolle des Tumorsuppressorproteins ATM in der 4-Methyltiobutylisothiocyanat vermittelten Proliferationsinhibition (2010)
  Bearbeiterin: Claudia Kleinhans
  Externer Betreuer: Prof. Dr. K.-F. Fischbach (Universität Freiburg, Fakultät für Biologie)
• Nachweis eines antigentoxischen Potentials von Senf in einer kontrollierten humanen Interventionsstudie unter Verwendung des Comet Assays (2009)
  Bearbeiterin: Julia Prinzhorn
  Externe Betreuerin: Prof. E. M. Herrmann (FH Osnabrück, Fachbereich Agrarwissenschaften und Landschaftsarchitektur)
• Die Bedeutung des Tumorsuppressors p53 für die 4- Methylthiobutyl Isothiocyanat-vermittelte Proliferationsinhibition und Telomerasesuppression (2009)
  Bearbeiterin: Meike Wagner
  Externer Betreuer: Prof. Neuhaus (Universität Freiburg, Fakultät für Biologie)

Spezielle Apparative Labor-Ausstattung:

• Durchflusszytometer FACSCalibur® mit Sorter
• PCR-System sowie RT-PCR-System (96 well Format)
• Dokumentationssysteme zur densitometrischen Auswertung von Immunoblots sowie DNA Gelen
• Multiwell ELISA-Reader (Tecan, InfiniTe M200) für Absorptions-, Fluoreszenz- und Lumineszenzmessungen
• Automatisches Zellzählgerät
• Nanodrop
• Auflicht-, Durchlicht- und Fluoreszenz-Mikroskope mit Life cell imaging-Einheit
• UV-Crosslinker