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Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin

Leistungsspektrum

Hämoglobindiagnostik

Hämoglobinanalysen

Indikation

Die Indikationen zur Hämoglobinanalyse sind:

  • mikrozytäre Anämien nach Ausschluss eines Eisenmangels
  • chronische hämolytische Anämie
  • hydrops fetalis unbekannter Genese
  • Polyglobulien
  • genetische Beratung und pränatale Diagnostik
  • unklare Anämie
  • Gefäßverschlusskrisen ungeklärter Ätiologie bei Patienten aus HbS und/oder HbC Gebieten
  • medikamenteninduzierte Anämien

Die Hämoglobinanalytik erfolgt mittels alkalischer und saurer Gelelektrophorese sowie hochauflösender HPLC.

Ursache der oben genannten Indikationen sind meist Hämoglobinopathien Dies sind Erkrankungen infolge defekter Hämoglobinbildung. Die Defekte betreffen alpha- oder beta-Ketten, sehr selten auch die delta-Ketten, meist ist eine Aminosäure in einer Peptidkette ausgetauscht. Es können aber auch Aminosäuren fehlen oder aber das Hämoglobin wird nur aus einer Kettenart gebildet. Grundsätzlich können Hämoglobinopathien in zwei Hauptgruppen unterteilt werden:

1. Hämoglobinstrukturvarianten – anomale Hämoglobine

2. Thalassämie-Syndrome

!Zahlreiche Mischformen existieren!

Wichtigste normale und anomale Hämoglobine, die mittels HPLC quantifiziert werden

Hämoglobin A0 und Hämoglobin A2

Sie stellen den Hauptbestandteil des adulten Blutes dar.

Referenzbereiche für Hämoglobine im adulten Blut:

HbA0 : 85- 90%

HbA2 : 1,5 – 3,2%

HbF: bis zu1%

HbA1: bis zu 8% (incl. HbA1c)

Hämoglobin F (fetales Hämoglobin)

HbF ist die dominierende Hämoglobinspezies des Feten und des Neugeborenen. Sie besteht aus 2 alpha- und 2 gamma-Ketten. HbF hat eine höhere Sauerstoffaffinität als HbA (adultes Hämoglobin). Dies beruht auf der fehlenden Interaktion des HbF mit 2,3 Bisphosphoglycerat durch strukturelle Unterschiede der gamma-Kette (fetales Hb) und der beta-Kette (adultes Hb). Neugeborene haben einen Anteil von 77 - 87 % HbF. Der Anteil an HbF ist bei Frühgeborenen höher als bei Reifgeborenen und darüber hinaus vom Lebensalter abhängig. Die Umschaltung der Synthese von HbF auf HbA findet um die 35. Schwangerschaftswoche statt. Nach dem 15. Lebenstag nimmt der Anteil an HbF ab und erreicht im Alter von 1-2 Monaten ca. 50 % und im Alter von 6 Monaten nahezu die Werte des Erwachsenen. ´

Ursache für erhöhte Werte bei Erwachsenen:

  • Beta Thalassämien :

            Thalassämia major 70 - 90 % HbF;

            Thalassämia intermedia 20 - 80 % HbF,

            Thalassämia minor variabler HbF-Anteil

  • HbS Homozygotie variabel bis 10%
  • Hereditäre Persistenz des fetalen Hämoglobins (HPFH)

Hämoglobin S

Sichelzellhämoglobin (HbS) ist eine Mutation der beta-Kette ß6 Glu -->Val. Das HbS, bei homozygoten Trägern, bzw. Kombinationen mit anderen Hämoglobinopathien und Thalassämien reagiert bei Sauerstoffentzug mit intraerythrozytärer Aggregation der Hämoglobinmoleküle und Sichelbildung der Erythrozyten mit hämolytischer Anämie. Die Erythrozyten verlieren ihre Verformbarkeit und können zu Verschlüssen der kleinen Gefäße führen. Die Patienten haben eine chronische hämolytische Anämie, sowie akute mitunter lebensbedrohliche Sichelzellkrisen. Daher sollte bei Patienten aus Endemiegebieten ein präoperativer Ausschluss einer Sichelzellanämie erfolgen.

Indikation: Verdacht auf HbS-Hämoglobinopathie (Gefäßverschlüsse, Apoplex, Sehminderung, schmerzhafte Krisen, Beinulcera etc.), präoperative Abklärung bei Patienten aus Endemiegebieten, Icterus neonatorum prolongatus.

Erhöhte Werte: Sichelzell-Erkrankung: HbS > 90 %,

Heterozygote HbS-Träger : HbS 35 - 45 %,

HbS/C-Erkrankung : HbS 50 %, HbA2 + HbC 50 %;

Hämoglobin C

Hämoglobin C liegt der Aminosäureaustausch ß6 Glu --> Lys zugrunde. Das gebildete Protein neigt zu intraerythrozytärer Kristallbildung und Aggregation der Hämoglobinmoleküle. Bei homozygoten Trägern tritt eine leichte bis mäßige hämolytische Anämie auf. Heterozygote Anlageträger sind im Allgemeinen gesund. Die Kombination mit weiteren Hämoglobindefekten kann jedoch zu einer verstärkten klinischen Symptomatik führen (HbSC, HbC+beta-Thal. etc.).

Indikation:

Verdacht auf HbC-Hämoglobinopathie (leichte bis mittelschwere hämolytische Anämie), bei Patienten aus Endemiegebieten.

Erhöhte Werte:

HbC-Krankheit > 97 % HbC;

heterozygoter HbC-Träger ca. 50 % HbC,

HbS/HbC-Träger 50 % HbC und 50 % HbS, HbA2 normal

Hämoglobin D

Hämoglobin D ist eine Mutation der beta-Kette (verschiedene Varianten bekannt). Bei homozygoten und heterozygoten Anlageträger treten keine klinischen Symptome auf. Die Kombination mit weiteren Hämoglobindefekten kann jedoch zu einer verstärkten Hämolyse und damit klinischen Symptomatik führen (HbSD etc.).

Hämoglobin E

Hämoglobin E ist eine Mutation der beta-Kette (beta26, Glu-Lys). Sie ist die häufigste Hämoglobinopathie weltweit und am häufigsten in Asien verbreitet. Eine Kombination mit anderen Hb-Anomalien ist oft wahrscheinlich. Insbesondere die Kombinationen mit alpha- und beta-Thalassämien sind klinisch relevant. Heterozygote Träger zeigen eine milde Hypochromie bzw. Mikrozytose, homozygote Träger zeigen eine milde hypochrome, mikrozytäre Anämie. Die Kombination mit weiteren Hämoglobindefekten kann jedoch zu einer verstärkten klinischen Symptomatik führen z.B. HbE / beta Thal., (entspricht einer Thalassämia intermedia oder major) habe / alpha Thal., HbES etc.

Erhöhte Werte

HbE-Krankheit : ca. 95 % HbE,

heterozygote HbE-Träger : 30 - 45 % HbE,

HbE/beta+Thalassämie : 25 - 80 % (HbE + HbA2) und 5 - 60 % HbF und 5 - 60 % HbA

HbE/beta0-Thalassämie : 75 - 87 % (HbE + HbA2) und 15 - 25 % HbF und 0 % HbA

Alle oben genannten Hämoglobine werden ausschließlich mittels einer hochauflösenden HPLC-Analytik quantifiziert und reportiert.

 

Alle oben genannten Hämoglobine werden ausschließlich mittels einer hochauflösenden HPLC-Analytik quantifiziert und reportiert.

Thalassämie Syndrome

Alpha Thalsassämien sind Erkrankungen, die durch eine reduzierte oder fehlende Synthese der alpha-Ketten des normalen Hämoglobins gekennzeichnet sind.

Alle Formen von partieller (1-3 ein alpha-Globingene sind betroffen) oder totaler Deletion (alle 4 alpha-Globingene sind betroffen) kommen vor. Ursprünglich in Afrika und im arabischen Raum verbreitet kommen sie heute weltweit vor.

αα / αα   Normalbefund

-α / αα    Heterozygote α+ Thalassämie (α -Thalassämie minima)

-α / -α     α+ Thalassämie (α -Thalassämie minor)

-- / αα     α0 Thalassämie (α -Thalassämie minor)

-- / -α      gemischt Heterozygotie α+/α0Thalassämie (HBH-Krankheit)

-- / --       α0 Thalassämie (HbBart´s Hydrops fetalis Syndrom)

Gekennzeichnet durch eine zunehmende Veränderung des Blutbildes von leichter Hypochromie bis hin zu einem nicht mit dem Leben vereinbaren Zustand.

Beta Thalassämien sind Erkrankungen, die durch eine reduzierte oder fehlende Synthese der beta Ketten des Hämoglobins gekennzeichnet sind. Molekulare Ursachen sind zahlreiche verschiedene beta-Globingen-Mutationen, die zu vielen unterschiedlich schwer verlaufenden Folgeerscheinungen führen.

Die meisten beta Thalassämien werden durch Punktmutationen verursacht, Deletionen sind eher selten.

β++ milde Anämien

β+ leichte Anämien

β0 schwergradige Anämien

Methoden

Hb-Elektrophorese

Durch mutationsbedingten Austausch von Aminosäuren bei der Hämoglobinsynthese kommt es zur Bildung von Hämoglobinvarianten, die aufgrund ihrer veränderten Ladung z.T. eine andere elektrische Mobilität aufweisen, als die physiologischen Hämoglobine A0, A2 und F. Sie können daher in der Hämoglobin-Elektrophorese von den physiologischen Hämoglobinen unterschieden und identifiziert werden.

Methoden

Hb-Elektrophorese

Durch mutationsbedingten Austausch von Aminosäuren bei der Hämoglobinsynthese kommt es zur Bildung von Hämoglobinvarianten, die aufgrund ihrer veränderten Ladung z.T. eine andere elektrische Mobilität aufweisen, als die physiologischen Hämoglobine A0, A2 und F. Sie können daher in der Hämoglobin-Elektrophorese von den physiologischen Hämoglobinen unterschieden und identifiziert werden. Der Nachweis von Thalassämien erfolgt ausschließlich über die hochauflösende HPLC (Quantifizierung von HbA2 und HbF) in Kombination mit den Werten des Blutbildes (Hämoglobin, MCV, MCH und Retikulozyten). Auch Mischformen (z.B. die Sichelzell-ß-Thalassämie) sind so nachweisbar.

 

Alkalische Hb-Elektrophorese

 Zunächst wird die alkalische Hb-Elektrophorese durchgeführt. Dazu wird auf einem Agarosegel in alkalischem Puffer (pH 8,5) das Hämolysat gewaschener Erythrozyten aufgetragen und getrennt.

Nach der Trennung können 5 Fraktionen unterschieden werden:

  • 1:. HbH, Hb Bart's 
  • 2: HbA0
  • 3: HbF
  • 4: HbS, HbD, HbG und Hb Lepore
  • 5: HbA2, HbC, HbE und HbO'Arab  

Bei gesunden Erwachsenen sollte nur in den Fraktionen 2 (HbA0 ≥ 96,8%) und 5 (HbA2 ≤ 3,2%) eine Bande nachweisbar sein.
Nach erfolgter Migration wird das Agarosegel mit Amidoschwarz gefärbt. Überschüssige Färbelösung wird durch eine saure Entfärbelösung entfernt. Die Elektropherogramme werden auf den getrockneten Gelen visuell auf Anomalien in den Verteilungsmustern untersucht und die Fraktionen densitometrisch quantifiziert.
Finden sich im Elektropherogramm der alkalischen Hämoglobin-Elektrophorese bzw. in der Quantifizierung anormale Verteilungsmuster, muss zur Identifikation der Hämoglobinvarianten eine saure Hb-Elektrophorese angeschlossen werden.

Saure Hb-Elektrophorese

In dieser ist die Auftrennung der unterschiedlichen Hämoglobine aufgrund des veränderten Milieus anders als in der alkalischen Elektrophorese. Auf diese Weise können Hämoglobine, die in der alkalischen Elektrophorese in der gleichen Fraktion laufen, voneinander getrennt dargestellt werde (z.B. HbS und HbD).

In der sauren Hb-Elektrophorese wird die HbA0-Fraktion aufgetrennt. Das glykosylierte Hämoglobin A1 läuft in der gleichen Fraktion wie HbF (Fraktion 5), während der nicht glykosylierte Anteil zusammen mit HbA2 und anderen Hämoglobinen in der 3. Fraktion läuft.

Nach der Trennung können 5 Fraktionen (alle anodisch von der Auftragsstelle) unterschieden werden:

  • 1. HbC
  • 2. HbS und HbO'Arab, 
  • 3. HbA0 und HbA2, sowie HbD, HbH, HbE, HbG und Hb Lepore
  • 4. Hb Bart's
  • 5. HbF und HbA1

Eine Differenzierung zwischen HbD, HbG und Hb Lepore ist mit diesen Methoden nicht möglich, da alle drei Hämoglobine sowohl in der alkalischen, als auch in der sauren Elektrophorese in der gleichen Fraktion laufen.

Die densitometrische Auswertung der alkalischen Elektropherogramme erlaubt eine prozentuale Angabe der vorhandenen Hämoglobine, sofern jede Bande nur ein Hämoglobin repräsentiert und die Banden nicht so dicht nebeneinander liegen, dass eine saubere Trennung unmöglich ist (z.B. HbS und HbF). Die saure Elektrophorese wird nur visuell ausgewertet.

Eine quantitative Aussage wird über die Gele nicht angeboten. Bei unauffälligem Analysenergebnis erfolgt nur eine Textdiagnose: „Kein Hinweis auf eine Hb-Anomalie“.

Sollten Auffälligkeiten wie die bereits oben genannten anormalen Hämoglobine auftauchen wird automatisch eine hochauflösende HPLC Analytik angeschlossen, deren Ergebnis dann auch quantitativ übermittelt wird.

Hochauflösende HPLC zur Quantifizierung der Hämoglobine

Die chromatographische Auftrennung des Hämoglobins dient zur Differentialdiagnose von Hämoglobinopathien. Sie wird durchgeführt wenn die elektrophoretische Auftrennung des Hämoglobins ungewöhnliche oder eindeutig pathologische Werte für die einzelnen zu erwartenden Hämoglobinfraktionen zeigt. Durch die chromatographische Auftrennung können die Fraktionen deutlich dargestellt werden. Darüber hinaus lassen sich spezielle Hämoglobinmoleküle wie HbS und HbC sowie weitere seltene Subfraktionen nur durch diese Methode eindeutig darstellen.

Probenmaterial

EDTA-Vollblut

Geräte

Gelelektrophorese: Sebia Hydrasis

2 und HPLC: Merck-Hitachi LaChrome elite

Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin

Hugstetter Straße 55
79106 Freiburg

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Telefon: 0761 270-35160
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